Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,570

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИИ СВИНЕЙ ЗАВОДСКОГО ТИПА КМ-1

Гришкова А.П. 1 Барков Д.А. 1
1 ФГАОУВО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» Юргинский технологический институт
Впервые проведены исследования генотипической структуры современной популяции животных кемеровского заводского типа мясных свиней (КМ-1) по генам ESR и RYR- 1. Исследования по выявлению полиморфизма по гену RYR- 1 у свиней типа КМ-1 показали, что из 87 голов мутация в гене RYR- 1 выявлена у одного животного, что составляет 1,1 %. Это указывает на высокую пластичность и стрессустойчивость животных. Так, частота мутантного гена RYR-1n была равна 0,0114, что значительно ниже, чем например в породе СМ-1. Установлено, что гетерозиготные хряки генотипа AG гена ESRF/FUT1, более устойчивые к колибактериозу, имели более высокую энергию роста, а свиноматки с этим генотипом лучшую сохранность поросят по сравнению с животными носителями генотипа GG.
ДНК-маркеры
гены
продуктивность свиней
стресс-чувствительность
колибактериоз
1. Бузлама В.С. Стресс в промышленном свиноводстве // Сельское хозяйство за рубежом. – 1976. – № 8. – С. 13–15.
2. Гончаренко Г.М. Генетическая структура популяций сельскохозяйственных животных Западной Сибири и использование маркёров в селекции: автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Г.М. Гончаренко. – Новосибирск, 2009. – 38 с.
3. Гончаренко Г.М., Бекенев В.А., Акулич Е.Г., Гришина Н.Б, Горячева Т.С., Кононенко Е.В., Фролова В.И. Феногенетический анализ маточного поголовья свиней крупной белой породы / Г.М. Гончаренко и др./ Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2011. – № 9–10. – С. 66–72.
4. Гришкова А.П. Использование генетических маркеров в оценке продуктивности свиней заводского типа КМ-1 / А.П. Гришкова, Г.М. Гончаренко и др.// Зоотехния – 2008 – № 10.
5. Зиновьева Н.А. Перспективы использования молекулярной генной диагностики / Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь // ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных: междунар. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2001. – С. 44–49.
6. Калашникова Л.А. ДНК – технологии оценки сельскохозяйственных животных / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко, Н.В. Рыжова, Е.П. Голубина // Лесные Поляны: Изд-во ВНИИплем, 199. – 148 с.
7. Князев С.П. Популяционно-генетические особенности иммунореактивности и стрессчувствительности свиней / С.П. Князев, К.В. Жучаев, В.В. Гарт, В.А. Петухов, И.И. Гудилин // Генетика. – 1995 – Т. 31, № 3. – С. 400–404.
8. Population Genetic Peculiarities of Immune Response and Stress Resistance in Pigs Knyazev S.P., Zhuchaev K.V., Petukhov V.L., Nezavitin A.G. Russian Journal of Genetics. – 1995. – Т. 31, № 3. – Р. 347–350.
9. Плященко С.И. Стрессы сельскохозяйственных животных / С.И. Плященко, В.Т. Сидоров. – М.: Агропромиздат, 1987. – 192 с.
10. Bell C., Kain Z. The pediatric Fnesthesia Handbook N // 2 ind Edition – St.- Louis: Mosby- Year Book. – 1997. – P. 485–500.
11. Wismer-Pedersen J. Quality of pork in relation to rate of pH change post mortem // Food Research, 1959. – Vol. 24. – P. 711–727.

В современных экономических условиях огромное значение приобретает производство высококачественной сельскохозяйственной продукции, в том числе свинины. Реализация данной задачи возможна только при наличии высокого генетического потенциала животных, формирующегося непрерывной селекционной работой.

К наиболее перспективным направлениям в современной селекции сельскохозяйственных животных относятся биотехнологические исследования, включая ПЦР-анализ полиморфизма генов, так или иначе сопряженных с хозяйственно полезными признаками и жизнеспособностью животных [3].

Изучению стрессов у свиней, их генетической сущности и селекции на устойчивость к неблагоприятным факторам посвящены многие работы [2, 7].

Из всех факторов, связанных с технологическими процессами, особенно сильным и неизбежным стрессом является отъём поросят от матерей. Ранний отъём поросят, применяемый в промышленной технологии, приводит к высокому их падежу (0,4–0,5 %), так как после отъёма возникает сильная стресс-реакция, в результате которой образуются язвы на слизистой желудочно-кишечного тракта [1].

Длительные стрессовые ситуации приводят к тахикардии, очаговому цианозу кожи, повышению температуры тела до 42–45 °С и молочному ацидозу [8]. При прогрессировании патологического процесса развивается тахикардия с последующей остановкой сердца в результате резкой гиперкалиемии на фоне гипоксии и метаболических нарушений [9]. После убоя таких животных проявляется синдромы бледной, мягкой, экссудативной PSE (Pale Soft Exudative) или тёмной, жёсткой, сухой свинины DFD (Dark Firm Dry). Было показано, что столь серьёзный дефект связан с аномальным изменением рH cкелетной мускулатуры после убоя [10].

Как метод прогнозирования стресс-чувствительности свиней используют тесты, характеризующие высшую нервную деятельность, креатинкиназный тест, метод «кризис отъема», метод локального адаптационного синдрома, содержание в шпике линоленовой кислоты, реакция на этанол.

Проблема стрессов в свиноводстве стоит особенно остро, так как при промышленной технологии их избежать невозможно. Поэтому исследования, связанные с выявлением свиней, устойчивых к стрессу, остаются актуальными. Доказано, что чувствительность к стрессам – наследственно обусловленный порок свиней, который чаще всего выявляется у свиней мясных пород. ПЦР-ПДРФ анализ позволяет выявлять всех носителей мутантного гена и выводить их из селекционного процесса, что обеспечивает более высокую сохранность поросят.

Исследования проведены в хозяйстве – оригинаторе по чистопородному разведению кемеровского заводского типа мясных свиней КМ-1 – ООО СХО «Заречье» Кемеровской области, лаборатории биотехнологии СибНИПТИЖ СО РАСХН.

Объектом исследований явились хряки-производители, свиноматки, поросята группы 0-2, ремонтный молодняк и подсвинки на контрольном откорме.

Полиморфизм структурных генов выявляли с помощью реакции ПЦР. Выделение ДНК проводили по методике, предложенной лабораторией «Медиген». Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в объеме 25 мкл. Исследования полиморфизма гена RYR-1 проводили по методике, описанной Калашниковой и др. [6]. Для выявления гена RYR-1 применяли два олигонуклеотидных праймера:

RYR 56: 1 5’-GTGCTGGАTGTCCTGTGT TCCCT – 3’

RYR 56: 2 5’-GTGGTGACATAGTTGATGAGG TTTG – 3’

Режим амплификации: «горячий старт» – 94 °С – 6 мин; денатурация – 94 °С – 1 мин., отжиг – 60 °С – 1 мин, элонгация – 72 °С – 1 мин; достойка матрично-праймерных комплексов проводится при 72 °С – 5 мин.

Концентрацию и специфичность амплификата оценивают электрофоретическим методом в 2 % агарозном геле. Визуализируется амплифицированный фрагмент RYR-1 с помощью трансиллюминатора в проходящем УФ – свете. Длина амплифицированного фрагмента составляет 134 п.н. Полученный фрагмент подвергали рестрикции рестриктазой Hin6I c соответствующим буфером.

Наличие на геле двух полос длиной 84 п.н. и 50 п.н. соответствовало гомозиготному генотипу NN; одной яркой, чёткой полосы и двух менее ярких длиной 134, 84,50 п.н. – гетерозиготный генотип Nn; одной яркой длиной 134 п.н. – гомозиготный генотип – nn.

Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма гена ESR F18/FUTI проводили с использованием следующей методики. После начальной денатурации при температуре 95 °С в течение 5 минут выполняли 35 циклов амплификации в следующем температурном режиме: 95 °С – 1 мин., 66 °С – 1 мин., 72 °С – 1 мин. Для амплификации фрагмента гена ESR F18/FUTI использовали праймеры ESR 1 и ECR 2

ESR 1–5’ CGC CAC CTC TGT CTG ACC TT – 3’

ESR 2–5’ AGG AGC GTG CCT GTC TAC CTC – 3’

Полученный амплификат подвергали гидролизу с рестриктазой BSTHH I с последовательностью узнавания GCG↓C. Отсутствие рестрикционного сайта соответствует аллелю А, в то время как его наличие – аллелю G.

Для анализа амплифицированных фрагментов ДНК и продуктов рестрикции использовали метод гель-электрофорез. Электрофоретическое разделение проводили при 120–135 В в 1,8–2 %-ном агарозном геле в буфере ТАЕ.

Полученные фрагменты, согласно методике соответствовали:

378 п.н. – АА, 291 и 87 п.н. – GG, 378, 291 и 87 – AG.

Исследованиями как отечественных, так и зарубежных учёных установлено, что более чувствительны к стрессам свиньи пород пьетрен и ландрас и менее подвержены стрессам свиньи крупной белой, йоркшир, дюрок. Исследования, проведенные на современном молекулярном уровне показали, что из 87 животных заводского типа КМ-1 частота мутации в гене RYR-1 составляет 0,0057 (табл. 1).

Таблица 1


Структура популяций свиней по локусу RYR 1

Популяция

n

Частота генотипов RYR1

Частота мутантного гена RYR 1n

N/N

N/n

n/n

КМ-1

87

0,989

0,0114

0

0,0057 + 0,0001

СМ-1 [27]

113

0,912

0,088

0

0,046 + 0,0002

Следует обратить внимание на тот факт, что две популяции свиней – КМ-1 и новый тип породы СМ-1 (сибирский), разводимые в одинаковых условиях Западной Сибири, значительно различаются по частоте стрессустойчивости. Частота мутантного гена у животных типа КМ-1 получена в несколько раз ниже, чем в породе СМ-1. Среди исследованных животных КМ-1 не выявлено ни одной гомозиготы RYR-1n.

Это означает, что при чистопородном разведении заводского типа КМ-1 по ряду количественных признаков сформирована уникальная в отношении стрессустойчивости популяция животных.

Не менее важной проблемой в свиноводстве остается сохранение молодняка, причиной гибели которого чаще всего бывает диарея. Как известно, возбудителем заболевания является кишечная палочка E.colli. Наряду с вакцинацией маток, в настоящее время разработан метод анализа вариантов гена ESRF18/FUT1, носители некоторых генотипов которого обладают более высокой устойчивостью к колибактериозу. Нашими исследованиями установлено, что генотип АА у свиней заводского типа КМ-1 встречается в 5 раз меньше, чем генотип GG, а аллель А в два раза меньше, чем альтернативный G (табл. 2). Около половины животных имеют гетерозиготный генотип AG.

Таблица 2

Генотипическая структура свиней КМ-1 по гену ESR

Генотип

n

Частота генотипа

наблюдаемая, %

Частота генотипа

ожидаемая, %

Частота аллеля

χ2

AA

4

8,0 ± 3,83

10,2 ± 4,28

А – 0,32

1,06

AG

24

48,0 ± 7,06

43,5 ± 7,01

G – 0,68

GG

22

44,0 ± 7,01

46,2 ± 7,05

 

 

 

Устойчивость или чувствительность к колибактериозу может оказывать влияние на проявление хозяйственно полезных признаков, особенно на сохранность поросят.

Установлено, что наличие генотипов гена ЕSRF18/FUТ1 не оказало влияния на изучаемые показатели свиноматок, за исключением сохранности поросят в гнезде к отъёму (табл. 3). У животных с генотипом AG сохранность поросят была выше на 10,1 % (Р < 0,01), чем у носителей генотипа GG.

Таблица 3

Продуктивность свиноматок с учётом генотипов гена ESRF18/FUT1

Показатель

Генотип

GG

AG

Возраст достижения 100 кг, дней

176,2 ± 2,80

181,1 ± 2,61

Толщина шпика, мм

23,0 ± 0,86

23,0 ± 0,54

Длина туловища, см

125,9 ± 0,69

126,4 ± 0,67

Многоплодие, гол.

10,1 ± 0,58

10,2 ± 1,22

Молочность, кг

54,6 ± 3,05

56,9 ± 2,30

Масса гнезда в 2 месяца, кг

188,4 ± 7,46

196,4 ± 6,21

Масса 1 поросёнка в 2 месяца, кг

22,6 ± 1,01

22,6 ± 0,93

Сохранность, %

82,1 ± 2,32

92,0 ± 2,96**

 

Аналогичные исследования по влиянию генотипов гена ESRF18/FUT1 на продуктивность хряков указывают на то, что гетерозиготные хряки с генотипом AG, устойчивые к колибактериозу, имели более высокую энергию роста и достигали 100 кг на 13,6 дней раньше (Р < 0,01), чем производители с альтернативным генотипом, где присутствует нежелательный аллель G (табл. 4).

Таблица 4

Продуктивность хряков с учётом генотипов гена ESRF18/FUT1

Показатель

GG

AG

Возраст достижения 100 кг, дней

179,7 ± 2,74**

166,1 ± 2,26

Толщина шпика, мм

21,6 ± 1,25

19,5 ± 0,65

Длина туловища, см

129,6 ± 0,88

130,5 ± 1,37

Многоплодие, гол.

8,9 ± 0,44

8,6 ± 0,48

Масса 1 поросёнка, кг

22,1 ± 0,47

22,5 ± 0,59


В свиноводстве за рубежом широко используется анализ на наличие нежелательной мутации в гене RYR-1, ответственной за предрасположенность животных мясных пород к злокачественной гипертермии.

Исследователями отмечено, что селекция свиней на улучшение мясных качеств приводит к снижению устойчивости к стрессам. По данным Н.А. Зиновьевой, более устойчивы к стрессу свиньи крупной белой породы [5]. Частота мутаций в этой породе находится в пределах 3,6–8,2 %. Незначительное количество животных с мутацией этого гена обнаружено у свиней породы СМ-1 (5,3 %), [4] в то же время у свиней крупной чёрной она выявлена у 13,6 % животных. Хорошей устойчивостью к стрессам характеризуется ливенская порода. В породе СМ-1 в смежных поколениях зафиксирована единичная встречаемость гетерозиготных носителей мутации и полное отсутствие гомозигот по рецессивному аллелю.

Проведённые исследования показали что, c целью планирования селекционного процесса, контроля стрессустойчивости и здоровья животных, а также максимального использования производителей, имеющих лучшее сочетание у потомства селекционируемых и других хозяйственно полезных признаков, таких как высокая скороспелость и конверсия корма, тонкий шпик необходимо осуществлять генетический мониторинг в популяциях племенных хозяйств по свиноводству с использованием ген маркёров – RYR-1n и ESRF18/FUT1.


Библиографическая ссылка

Гришкова А.П., Барков Д.А. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИИ СВИНЕЙ ЗАВОДСКОГО ТИПА КМ-1 // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 3-2. – С. 241-244;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=6522 (дата обращения: 18.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252