Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Лыков А.П. 1 Лыкова Ю.А. 2 Бондаренко О.В. 1 Повещенко О.В. 1 Суровцева М.А. 1 Гайдуль К.В. 3 Душкин А.В. 4 Коненков В.И. 1

---

1 НИИКЭЛ

2 НГТУ

3 НИИФКИ

4 ИХТТМ СО РАН

Проведено исследование эффекта прекондиционирования мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток с наноструктурированными частицами диоксида кремния. Показано, что наночастицы диоксида кремния подавляют адгезию к пластику и пролиферацию мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток по мере возрастания концентрации наночастиц диоксида кремния. В основе подавления пролиферации мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лежит активация апоптоза клеток.

Статья в формате PDF

823 KB

мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки

наночастицы диоксида кремния

пролиферация

адгезия

клеточный цикл

МТТ-тест

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М: Практика. – 1999. – 459с.

2. Душкин А.В., Лыков А.П., Ларина О.Н. и др. Сравнительная характеристика антимикробной активности механохимически модифицированных и сорбированных на наноструктурированных частицах диоксида кремния форм цефтазидима на примере экспериментального сепсиса у мышей (CBA x C57Bl6)F1, индуцированного Pseudomonas aeruginosa // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 4. – С. 47-52.

3. Aguirre A., Planell A., Engel E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2010. – Vol. 400. – Р. 284-291.

4. Cao B., Yang M., Zhu Y. et al. Stem Cells Loaded with Nanoparticles as a Drug Carrier for In Vivo Breast Cancer Therapy // Adv. Mater. – 2014. – Vol. 26. – P. 4627–4631.

5. Fujioka K., Hanada S., Inoue Y. et al. Effects of Silica and Titanium Oxide Particles on a Human Neural Stem Cell Line: Morphology, Mitochondrial Activity, and Gene Expression of Differentiation Markers // Int. J. Mol. Sci. – 2014. – Vol. 15. – P. 11742-11759.

6. Ogneva I.V., Buravkov S.V., Shubenkov A.N. et al. Mechanical characteristics of mesenchymal stem cells under impact of silica-based nanoparticles // Nanoscale Research Letters. – 2014. http://www.nanoscalereslett.com/content/9/1/284.

7. Park E-J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro //Toxicology Letters. – 2009. – Vol. 184. – P.18-25.

8. Periasamy V.S., Athinarayanan J., Akbarsha M.A. et al. Silica nanoparticles induced metabolic stress through EGR1, CCND, and E2F1 genes in human mesenchymal stem cells. // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2015. – Vol. 175. – P. 1181-1192.

9. Seleem M.N., Munusamy P., Ranjan A. et al. Silica-Antibiotic hybrid nanoparticles for targeting intracellular pathogens // Antimicrobial agents and chemotherapy. – 2009. – P. 4270-4274.

В последнее время особый интерес представляют наноматериалы из наноструктурированных частиц диоксида кремния (SiO2-нч) в виде аморфной (кремнезем) и кристаллической (кварц) модификации [2, 4-9]. Форма частиц близка к сферической, а размер с учетом условий получения варьирует от 5 до 80 нм. При попадании в организм SiO2-нч они биодеградируют в почках до орто-кремниевой кислоты и выводятся с мочой [9]. Поэтому SiO2-нч рассматриваются как перспективный, биосовместимый и биодеградируемый материал способный проникать в внутрь клетки, для разработки на его основе лекарственных препаратов и диагностических средств [2].

С другой стороны, достижения в клеточных технологиях позволили в последнее время получать в достаточном количестве аутологичные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК). ММСК обладают противовоспалительной активностью, способны стимулировать процессы неоангиогенеза в зоне ишемии органов и тканей, способны к цитодифференцировке в адипогенном, остеогенном, хондрогенном и миогенном направлениях, а функциональная активность ММСК регулируется различными факторами внешней и внутренней среды [3].

В тоже время, нет единого мнения о токсичности SiO2-нч, в частности при концентрациях свыше 190 мкг/мл отмечен токсический эффект на эпителиальную клеточную линию человека, а при внутрибрюшинном введении SiO2-нч в дозе 50 мкг/кг мышам отмечается активация перитонеальных макрофагов [7].

С учетом вышеизложенного, целью исследования стало изучение влияния прекондиционирования с SiO2-нч на морфофункциональные свойства костномозговых ММСК крыс Wistar.

Материалы и методы исследования

Коллоидный диоксид кремния (энтеросорбент «Полисорб», Россия) подвергали механической обработке в шаровой мельнице (энергонапряженность 1g) для получения большего количества мелкодисперсных (менее 5 мкм) SiO2-нч. Эксперименты на 5 крысах-самках линии Wistar с массой 300-350 г. проведены в соответствии с соблюдением принципов Хельсинской декларации BMA (2000). Ядросодержащие клетки костного мозга получали при помощи перфузии бедренных костей лабораторных животных и использовали для выделения ММСК. Для этого ядросодержащие клетки костного мозга ресуспендировали в среде DMEM (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Далее ядросодержащие клетки костного мозга инкубировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM (Биолот, СПб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Хабаровск), 2 мM L-глютамина (ICN, США) и 15 % FCS при 37°С в атмосфере 5 % СО2. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного слоя. Снятие ММСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина/0,02 % раствора ЭДТА (ICN, США). Адгезию ММСК к пластику при кондиционировании с различными дозами SiO2-нч (2, 20 и 200 мкг/мл) оценивали под инвертированным микроскопом Olympus (Япония). На проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD, США) изучали влияние кондиционирования ММСК с SiO2-нч на клеточный цикл. Пролиферативный потенциал ММСК изучали по включению по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma, США) при длине волны 492 нм на спектрофотометре (Stat Fax 2100, США) через 48 часов при со-культивировании с различными дозами SiO2-нч и выражали в условных единицах оптической плотности. Индекс влияния SiO2-нч высчитывали по формуле: ИВ= (1 – опыт/контроль) х 100 %. Уровень продукции стойких метаболитов оксида азота (mNO) ММСК при кондиционировании с различными дозами SiO2-нч оценивали с помощью реактива Грейсса. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна-Уитни, и принималась при значениях p < 0,05 [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Ранее было показано, что коллоидный аморфный диоксид кремния состоял из округлых наночастиц размером 20-100 ни, сорбированных в рыхлые агрегаты размером 5-100 мкм [2]. В водной среде агрегаты частично разрушались. Количество частиц коллоидного диоксида кремния менее 3 мкм не превышало 0,5 %, менее 5 мкм – 5,3 % и менее 10 мкм – 25,7 % при исследовании гранулометрического состава микрокомпозиционного исходного материала диоксида кремния. После механического измельчения массовая доля мелких (менее 3-5 мкм), потенциально наиболее биологически активных частиц увеличивается при механохимической активации от 23 % до 38 %.

Как видно из рис. 1, отмечено влияние SiO2-нч на адгезию ММСК к пластику. Так при концентрациях 20 мкг/мл и 200 мкг/мл SiO2-нч при микроскопии уже через 3 часа после посадки клеток в лунки отмечено появление областей, которые не заселяется ММСК (рис. 1 д, ж). А через 48 часов это наиболее ярко проявляется при концентрации 200 мкг/мл SiO2-нч (рис. 1 з).

Следовательно, SiO2-нч в высоких концентрациях препятствуют прикреплению ММСК к пластику.

Показано, что SiO2-нч статистически значимо снижает интенсивность пролиферации ММСК, что подтверждается не только абсолютными величинами поглощения клетками МТТ, но и интегральным показателем влияния SiO2-нч на ММСК (табл. 1). Показано, что максимальный ингибирующий эффект SiO2-нч проявляется при дозе 200 мкг/мл.

В то же время, нами не отмечено статистически значимого влияния SiO2-нч на секреторный потенциал ММСК, определяемый по уровню продукции стойких метаболитов оксида азота.

Показано наличие прямой и сильной взаимосвязи между спонтанным уровнем пролиферации ММСК и уровнем продукции стойких метаболитов оксида азота при кондиционировании с 20 мкг/мл SiO2-нч. Это подтверждается и данными визуализации реакции МТТ – теста (рис. 2). Видно, что количество ММСК гранул МТТ преобразованных в формазан меньше по мере возрастания дозы SiO2-нч.

Таким образом, SiO2-нч в высоких дозах подавляют пролиферативный потенциал ММСК.

Следующим этапом исследования стал анализ нахождения ММСК в фазах клеточного цикла при кондиционировании их с различными дозами SiO2-нч. Показано, что SiO2-нч статистически значимо увеличивает количество апоптотических клеток (табл. 2). Также SiO2-нч статистически значимо уменьшают количество ММСК в G0G1, G2+M и S-фазах клеточного цикла.

Таким образом, высокие дозы SiO2-нч стимулируют апоптоз ММСК.

Полученные нами результаты влияния SiO2-нч на ММСК не противоречат литературным данным. Так в работе авторов [4] показано, что SiO2-нч проявляют токсическое действие на ММСК крысы при концентрациях свыше 80 мкг/мл. В основе токсического эффекта SiO2-нч на ММСК человека лежит активация генов оксидативного стресса [8]. Более того, SiO2-нч наряду с наночастицами оксида титана проявляют токсический эффект и на стволовые нервные клетки человека при концентрации 100 мкг/мл, что связано с нарушением экспрессии маркеров стволовых клеток нервной системы и маркеров нейронов [5].

Рис. 1. Эффект прекондиционирования ММСК с SiO2-нч на адгезию к пластику: а – ММСК через 3 часа, б – ММСК через 48 часов, в – ММСК+2 мкг/мл SiO2-нч через 3 часа, г – ММСК+2 мкг/мл SiO2-нч через 48 часов, д – ММСК+20 мкг/мл SiO2-нч через 3 часа, е – ММСК+20 мкг/мл SiO2-нч через 48часов, ж – ММСК+200 мкг/мл SiO2-нч через 3 часа, з – ММСК+200мкг/мл SiO2-нч через 48 часов. Нативный препарат (х400)

Таблица 1

Эффект прекондиционирования ММСК с SiO2-нч (Me; LQ-UQ)

Примечание. ММСК – мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки; SiO2-нч – наноструктурированные частицы диоксида кремния; * – достоверность различия с ММСК p < 0,05; # – достоверность различия с ММСК+2 мкг/мл SiO2-нч p < 0,05; $ – достоверность различия с ММСК+20 мкг/мл SiO2-нч p < 0,05.

Рис. 2. Эффект прекондиционирования ММСК с SiO2-нч на поглощение МТТ: а – ММСК, б – ММСК+2 мкг/мл SiO2-нч, в – ММСК+20 мкг/мл SiO2-нч, г – ММСК+200 мкг/мл SiO2-нч. Нативный препарат (х400)

Таблица 2

Эффект прекондиционирования ММСК с SiO2-нч на клеточный цикл (Me; LQ-UQ)

Примечание. ММСК – мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки; SiO2-нч – наноструктурированные частицы диоксида кремния; * – достоверность различия с ММСК p < 0,05; # – достоверность различия с ММСК+2 мкг/мл SiO2-нч p < 0,05; $ – достоверность различия с ММСК+20 мкг/мл SiO2-нч p < 0,05.

Заключение

Таким образом, наночастицы диоксида кремния проявляют токсическое влияние на мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки в дозе 200 мкг/мл. Необходимо учитывать побочные эффекты наноструктурированных частиц диоксида кремния при применении их в медицине, фармации и при разработке диагностических средств, направленных на определение живых клеток с помощью внедрения светящихся меток, так как высока вероятность гибели клеток от наночастиц до момента их детекции на специальной аппаратуре.

Библиографическая ссылка