Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДОВ АНАЛИЗА КОМПОНЕНТОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ БЕТУЛИНА И ТИМОЛА В МАСЛЕ СЕМЯН ТЫКВЫ CUCURBITA PEPO

Воробьева О.А. 1 Мельникова Н.Б. 1
1 Нижегородская Медицинская Академия
Разработаны и валидированы методики количественного определения бетулина и каротиноидов, токоферолов и β-ситостерола в фитокомпозиции бетулина и тимола в масле семян тыквы: Разработана пробоподготовка для ВЭЖХ-анализа масла семян тыквы и фитокомпозиции на его основе, включающая омыление,введение в щелочной раствор смеси аскорбиновой кислоты и тимола при их массовом соотношении 2.5:1. Содержание бетулина было определено обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией(ОФ-ВЭЖХ) с использованием методики«введено-найдено» (по модельным смесям) в изократическом режиме (диодно-матричный детектор, λ = 210 нм; подвижная фаза ацетонитрил:вода (90:10)). Методика удовлетворяет требованиям по правильности, линейности, сходимости, робастности, и характеризуется пределом обнаружения (равном 0.0075 ± 0.0017 мг/мл), пределом количественного определения (равном 0.0500 ± 0.0011 мг/мл). Определено суммарное содержание каротиноидов–48.3 мкг %,спектрофотометрическим методом после адсорбционной очистки от других пигментов и компонентов масла семян тыквы. Методика валидирована по показателям правильности, линейности, сходимости. С использованием ОФ-ВЭЖХ с диодно-матричным детектором методом «введено-найдено» (методика добавок) рассчитано содержание α-токоферола – 7.50 мг %и γ-токоферола – 5.77 мг % (λ = 284 нм; подвижная фаза метанол:ацетонитрил:дихлорметан (50:44:6)) и β-ситостерола – 105 мг % (λ = 210 нм; подвижная фаза ацетонитрил:этанол 96 % (85:15)). Методики характеризуются как правильные, удовлетворяют требованиям линейности, сходимости, робастности, и имеют предел обнаружения (равный 0.15 ± 0.01 мг/л для α и γ-токоферолов; 0.0075 ± 0.0002 мг/мл для β-ситостерола), предел количественного определения (равный 1.00 ± 0.02 мг/л для α и γ-токоферолов; 0.050 ± 0.003 мг/мл для β-ситостерола).
бетулин
масло семян тыквы
токолы
каротиноиды
фитостеролы
валидация
Кислицин А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение. Состав, применение. Обзор. // Химия древесины. – 1994. – № 3. – С. 3–28.
Сергеев Д.В., Прошин С.Н., Дьячук Г.И. Ранозаживляющие и противоожоговые свойства бетулин содержащих мазей // Медико-биологические и социально-биологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. – 2011. – № 2. – С. 76–79.
Сергеев Д.В. Репаративные эффекты бетулина // Профилактическая медицина: мат. конф. (СПб,СЗГМУим. И.И. Мечникова, 2011г.). – СПб, 2011. – С. 280–281.
Azevedo-Meleiro C., Rodriguez-Amaya D. Qualitative and quantitative differences in carotenoid composition among Cucurbita moschata, Cucurbita maxima, and Cucurbita pepo // J. Agric. Food Chem. – 2007. Vol.10. №55. – P. 4027–4033.
Fruhwirth G.O., Hermetter A. Seeds and oil of the Styrian oil pumpkin: Components and biological activities //Eur. J. Lipid Sci. Technol. – 2007. Vol.11. № 109. – P. 1128–1140.
Нowitt С.А., Pogson B.J. Carotenoid accumulation and function in seeds // Plant, Cell and Environment. – 2006. – № 29. – P. 435–445.
Kreck M., Kurbel P., et al. Identification and quantification of carotenoids in pumpkin cultivars (Cucurbita maxima L.) and juices by liquid chromatography with ultraviolet-diode array detection // Journal of Applied Botany and Food Quality. – 2006. – № 80. – P. 93–99.
Rodriguez-Amaya D. A guide to carotenoid analysis in foods: International Life Science Institute Press. – Washington, DC, 1999.
Venu, S. Oxidation Reactions of Thymol: A Pulse Radiolysis and Theoretical Study //J. Phys. Chem. – 2013. Vol. 2. № 117. – P. 291–299.
Whitaker J. Current Protocols in Food Analytical Chemistry: John Wiley & Sons, Inc. – NJ, 2001. – P. 1191.

По данным ВОЗ, более 20 % населения Земли страдает кожными заболеваниями. При лечении такого рода заболеваний наряду с общей терапией широко используются лекарственные средства наружного применения. В зависимости от рода заболевания, приемлемыми являются различные лекарственные формы: от примочек до мазей. Правильно подобранный состав лекарственного средства действует на течение заболевания в ряде случаев более интенсивно, чем основное действующее вещество. С другой стороны, зачастую, какой-либо из компонентов – вспомогательных веществ или основы, может не просто обесценить действие лекарственного вещества, но и усугубляет проявление болезни.

Лекарственные формы на основе жирных масел представляют особый интерес для дерматологии в связи с богатым химическим составом. В настоящей работе рассматривается фитокомпозиция на основе масла семян тыквы Cucurbita Pepo. Биологически активные вещества в составе масла благоприятным образом влияют на течение дерматологических заболеваний: необходимый баланс жирных кислот, а также высокое содержание токолов, каротиноидов и фитостеролов в тыквенном масле делают его перспективным компонентом в составе сложных фармацевтических композиций. Для усиления противовоспалительного действия в состав фитокомпозиции нами предложено вводить бетулин – пентациклический тритерпеноид, основной компонент бересты березы. По химической структуре бетулин близок к глюкокортикостероидам, но в отличие от них не проявляет известных побочных эффектов и не вызывает привыкания. Высокая противовоспалительная активность соединения, а также его репаративные свойства, подтвержденные в ряде работ [1, 2, 3], обосновывают актуальность его введения в разрабатываемую композицию. С целью стабилизации композиции, в ее состав предложено вводить вещество, имеющее высокий антиоксидантный потенциал. В качестве такого соединения был использован тимол – монотерпеновый фенол, основной компонент эфирных масел тимьяна ползучего и душицы обыкновенной. Кроме антиоксидантного действия (защита токолов и каротиноидов в составе масла семян тыквы), тимол в данной композиции является сорастворяющим агентом для бетулина, вероятно, образуя с ним комплексы включения.

Предложенная фармацевтическая композиция имела следующий состав (масс. %): бетулин – 2.1, тимол – 6.4, масло семян тыквы (МСТ) – до 100.0 и может быть введена в состав сложных лекарственных форм.

Количественное определение ингредиентов в фитокомпозиции является крайне трудной аналитической задачей, поскольку МСТ имеет многокомпонентный состав, быстро окисляется, а проведение анализа как растительных масел, так и активных действующих веществ в композиции сопряжено со значительными сложностями. Для таких масел, как МСТ, основную трудность представляет собой пробоподготовка, которую обычно осуществляют омылением водными или спиртовыми растворами щелочей. В процессе омыления в жестких условиях (высокая температура смеси в течение продолжительного времени) возможны не только окисление, но и деструкция ценных биологически активных веществ, вследствие чего требуется защита компонентов от нежелательных процессов. В международном протоколе анализа Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001 для жирных масел в качестве такой защиты используется аскорбиновая кислота. Однако, в случае анализа ряда масел, в том числе МСТ, введение аскорбиновой кислоты не позволяет обеспечить стабильность композиции.

С другой стороны, количественное определение компонентов (более 20 в МСТ), несмотря на многочисленные публикации [4, 5, 7, 10] также являются нерешенной задачей, и в настоящее время отсутствуют унифицированные методики анализа наиболее ценных компонентов в МСТ.

Цель данной работы – разработка и валидация методик количественного определения компонентов, оказывающих основное влияние на воспалительный процесс, по суммарному содержанию каротиноидов, токоферолов и β-ситостерола, и бетулина в фитокомпозиции бетулина и тимола в масле семян тыквы.

Материалы и методы исследования

Материалы и реактивы. ( ± )α-токоферол (Supelco, 47783), рац-β-токоферол (50 мг/мл в гексане, Supelco, 46401-U), γ-токоферол (Supelco, 47785), δ-токоферол(Supelco, 47784), β-каротин (Sigma, 22040), β-ситостерол 95 %, масло семян тыквы (ФСП 42-8110-06), бетулин98 % (Sigma, 473-98-3), ацетонитрил для хроматографии сорт 0 (ТУ 2636-040-44493179-00), гидроксид калия марки х.ч. (ГОСТ 24363-80), азот, оксид магния марки х.ч. (ГОСТ 4526-75), аскорбиновая кислотамарки х.ч. (ГОСТ 4815-76), тимолмарки х.ч. (ТУ 6-09-3736-79), этанол марки о.с.ч., гексан марки х.ч., метанол марки о.с.ч, дихлорметан марки о.с.ч., вода очищенная, полученная на установке «Elix-3» фирмы «MILLIPORE», удельное сопротивление менее 0,2 µСм.

Анализ электронных спектров был выполнен на UV-vis спектрофотометреSpecordS100 Bioline (Analytic Jena, Германия), толщина кварцевой кюветы 10 мм. Измеряли оптическую плотность в интервале длин волн 330 – 800 нм стандартных растворов и испытуемого раствора трижды. Гексановый экстракт предварительно пропускали через колонку, заполненную оксидом магния. Использовали гексан в качестве раствора сравнения. Для построения калибровочной кривой измеряли оптическую плотность на длине волны λmax = 424 нм от базовой линии, вычисляя значения средней оптической плотности.

Суммарное содержание каротиноидов (в мг) на 100 г композиции (мг %) рассчитывали по формуле:

vorobjv01.wmf

где Анабл. – оптическая плотность исследуемого раствора композиции в гексане; b – поправка оптической плотности по отношению к базовой линии; V – анализируемый объем раствора, мл; vorobjv02.wmf – удельный коэффициент экстинкции; С °– концентрация 1 % раствора, равная 10 мг/мл.

ВЭЖХ-анализ бетулина, токоферолов и β-ситостерола проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе марки Shimadzu LC-10 Avp в обращенно-фазовом режиме, колонка Discovery C18 (250×4.6 mm, 5μm) с диодно-матричным УФ-детектором. Условия хроматографирования бетулина: подвижная фаза ацетонитрил—вода 90:10 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 40 °C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длинах волн 206 и 210 нм, время анализа 20 мин. Условия хроматографирования токоферолов: подвижная фаза метанол-ацетонитрил-дихлорметан 50:44:6 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 30⁰C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длине волны 284 нм, время анализа 30 мин.Условия хроматографирования β-ситостерола: подвижная фаза спирт этиловый 96 %-ацетонитрил 15:85 (υ/υ) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 40 °C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длине волны 210 нм, время анализа 30 мин.

Приготовление стандартных растворов из стандартов

Стандарт исходный

С0, %

С, стандартных растворов

МСТ

100

0.01; 0.02; 0.03 гмл

α-токоферол

100

1.02; 4.08; 10.20; 51.00 мгл

γ-токоферол

0.005

1.0; 4.0; 10.0; 50.0 мгл

β-ситостерол

95

0.052; 0.078;0.260 мгмл

бетулин

98

0.063; 0.125; 0.250; 0.500; 1.000 мгмл

Приготовление модельных смесей 1, 2, 3: 0.1 г (точная навеска) бетулина помещали в ступку, перетирали с добавлением 1 мл спирта этилового 96 %, добавляли 0.5 г тимола, 0.2 г аскорбиновой кислоты, при перемешивании вводили 0.5; 1.0 и 2.0 г МСТ. Смесь перетирали пестиком до однородной суспензии. Перед анализом на наличие токоферолов и фитостеролов смесь омыляли согласно приведенной ниже методике.

Приготовление модельных смесей 4, 5, 6 выполняли аналогично процедуре приготовления модельных смесей 1,2,3, используя 0.05 г; 0.1 г; 0.15 г (точной навески) бетулина. Состав смеси: 0.5 г тимола; 0.2 г аскорбиновой кислоты; 2.0 г МСТ. Перед анализом на наличие токоферолов и фитостеролов смесь омыляли согласно приведенной ниже методике.

Методика пробоподготовки образцов для анализа токоферолов и фитостеролов:

Модельную смесь растворяют в 50 мл спирта этилового 96 %, добавляют 30 мл 60 масс. % водного раствора КОН и выдерживают образец в течение 30 мин на водяной бане при 70 °C, периодически перемешивая. После указанного времени к смеси, разделившейся на 2 фазы (нижняя – розоватая, верхняя – желтая), после охлаждения добавляют 100 мл воды очищенной (смесь становится гомогенной) и экстрагируют полученный раствор двумя порциями гексана по 100 мл, взбалтывая фазы каждый раз в течение 1 минуты. Полученное гексановое извлечение обрабатывают 100 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты, а затем дважды водой порциями по 100 мл, после чего осушают полученный раствор безводным Na2SO4. Гексан удаляют в токе азота до остаточного объема 15 мл и полученный раствор пропускают через колонку с MgO диаметром 1.5 см, высотой 5 см для очистки от каротиноидов. Колонку промывают двумя порциями гексана по 25 мл и полученный гексановый раствор отгоняют в токе азота досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл элюента.

Статистическую обработку проводили по программе Statistica 7.0 (р < 0.05).

Результаты исследования и их обсуждение

UV-Vis – анализ количественного содержания каротиноидов в композиции.

На рис.1 представлена типичная картина электронного спектра гексанового раствора композиции. В спектре наблюдались основные полосы с максимумами поглощения 424 и 434 нм. Каротиноиды, поглощающие в этой области спектра, преимущественно представлены каротиноидами β-ряда, а именно, β-криптоксантином, зеаксантином и виолаксантином [6]. Как правило, каротиноиды образуются путем перехода гидроксилированных каротиноидов в эпоксисоединения (виолаксантин), или возможным дальнейшим окислением и отщеплением эпоксигруппы [8]. Кроме того, в присутствии аскорбиновой кислоты на свету возможно фотовосстановление каротиноидов (образование атероксантина и зеаксантина). Анализ интенсивности поглощения в области 424 и 434 нм, в которой поглощают все каротиноиды, позволяет количественно оценить суммарное содержание каротиноидов в МСТ.

Для удаления следов хлорофилловых соединений, поглощающих в области 550-650 нм, нами проводилась адсорбционная очистка гексанового раствора с использованием колонки, заполненной адсорбентом основного характера. Показано, что наиболее полная очистка достигается при использовании оксида магния.

Калибровочные графики зависимостей интенсивностей поглощения А при 424 и 434 нм от концентрации МСТ имеют линейный характер. На рис. 1 (б) представлена зависимость А = f(m) по λ = 424 нм, соответствующая уравнению y = 0.4800x + 0.0016 (R2 = 0.9998), на основании которой рассчитан vorobjv03.wmf, равный 2515.

Суммарное содержание каротинов (в мг) на 100 г МСТ, рассчитанное по формуле 1, равно 0.0483 ± 0.0013мг % (48.3 мкг %). Валидационные характеристики по показателям линейности, сходимости, правильности представлены в табл. 1, 2.

vor1.wmf

Масса МСТ, г

Оптическая плотность А (424 нм)

0.25

0.1216

0.50

0.2416

0.75

0.3616

Рис. 1. Электронные спектры гексановых растворов каротиноидов – раствор композиции в гексане; врезка – зависимость A = f (CМСТ)

Таблица 1

Определение сходимости методики количественного определения суммы каротиноидов в композиции по модельным смесям

Показатели

Повторность

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Сумма каротиноидов, мкг %

24.0

24.3

23.8

47.9

48.1

47.5

96.4

95.6

95.8

Хср.

24.01

47.80

95.93

RSD, %

1.06

0.64

0.44

Таблица 2

Результаты установления правильности методики количественного определения каротиноидов в МСТметодом добавок

С каротиноидов, мкг %

Добавлено СО каротина, мкг %

Рассчитано, мкг %

Найдено, мкг %

Выход,

(Открываемость) %

24

10

34

32.3

95.0

24

10

34

31.8

93.5

24

10

34

33.4

98.2

48

20

68

67.8

99,7

48

20

68

65.3

96,0

48

20

68

66.4

97.7

96

30

126

125.7

99.8

96

30

126

126.1

100.1

96

30

126

126.5

100.4

Хср. = 97.81 %

Определение линейности проводили на 3 уровнях концентраций от ожидаемого содержания суммы каротиноидов в композиции. Критерием приемлемости и линейности методики является коэффициент корреляции, величина которого R2 = 0.9998, следовательно, в анализируемой области концентраций методика является линейной (рис. 1).

vor2a.wmf

а) время омыления 30 мин

vor2b.wmf

б) время омыления 1 час

Токол

τуд., мин

Площадь

Sγ-T /Sα-T

30 мин

1 час

30 мин

1 час

α-T

11.47

2010626

1892732

6:1

1:1.5

γ-T

9.71

11383614

846250

Рис. 2. ВЭЖ-хроматограммы композиции с различным временем омыления: а) 30 мин и б) 1 час. Элюент – 44:50:6, v/v (ацетонитрил:метанол:дихлорметан), скорость потока 1.0 мл/мин, УФ-детектор (284 нм), 30 °С

Сходимость методики определяли в 3 повторностях. Критерий приемлемости, выражаемый через величину относительного стандартного отклонения (RSD, %), составляющей 0.71 % (табл. 1), удовлетворяет требованиям методики по параметру сходимости.

Правильность методики устанавливали методом добавок «введено-найдено» путем измерения количественного содержания суммы каротиноидов в растворах при добавлении определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Отношение количества введенного β,β-каротина к найденному (Хср) в % соответствовало 97,81 %, что характеризует разработанную методику как правильную (табл. 2).

ОФ-ВЭЖХ– анализ содержания токоферолов и β-ситостерола в фитокомпозиции. Нами показано, что введение аскорбиновой кислоты в омыляемую смесь в рекомендуемых Международным протоколом концентрациях, не обеспечивает стабильности системы: приводит к частичному окислению токоферолов, каротиноидов и деструкции β-ситостерола, что выражалось в невоспроизводимости результатов по количественному определению. В качестве антиоксиданта, препятствующего разрушению компонентов МСТ, для проведения пробоподготовки нами предложено использовать тимол. Выбор тимола обусловлен тем, что, как показано в работе Venu, S., 2013, тимол способен в паре с аскорбиновой кислотой проявлять свойства сильного восстановителя, регенерируя окисленную аскорбиновую кислоту [9]. В дальнейшем все эксперименты при пробоподготовке проводились в присутствии смеси тимола и аскорбиновой кислоты при их массовом соотношении 2.5:1(25 % концентрации тимола по отношению к фитокомпозиции). На рис. 2 приведены ВЭЖ-хроматограммы токолов в композиции после омыления жировой фракции в течение 30 и 60 минут в присутствии смеси тимола и аскорбиновой кислоты.

Данные рис. 2 показывают большое влияние времени омыления на состав токолов в композиции. При омылении в течение 30 минут токолы представлены основными тремя компонентами: α-токоферолом (α-Т) (τ = 11.47 мин), γ-токоферолом (γ-Т) (τ = 9.71 мин) и γ-токотриенолом (γ-ТТ) (τ = 7.34 мин). Соотнесение пиков α- и γ-Т было выполнено с использованием их стандартных образцов, а время выхода γ-Т в анализируемых условиях отнесено в соответствии с литературными данными, где анализ проводился в сопоставимых условиях [10]. Показано, что после 30-минутного омыления площадь пика γ-Т в 6 раз выше, чем α-Т, а площадь пика γ-ТТ существенно больше, чем у α-Т (рис. 2, б) . После длительного омыления (60 минут), вероятно, происходит частичный переход γ-Т в γ-ТТ и концентрация γ-Т резко уменьшается, при этом соотношение площади пика γ-Т к α-Т составляет 1:1.5.

Учитывая этот факт, в дальнейшем омыление проводили в течение 30 минут.

Количественное содержание α- и γ-Т в фитокомпозиции, выполняли с использованием калибровочного графика по стандартам α- и γ-Т (рис. 3). Рассчитанная концентрация α- и γ-Т равна 7.50 мг % и 5.77 мг %, соответственно.

Определение линейности проводили на 4 уровнях концентраций от ожидаемого содержания α- и γ – Т в фитокомпозиции, аналогично определению каротиноидов (рис. 3). Уравнения линейной регрессии и значения коэффициентов корреляции характеризуют приемлемость данной методики по показателю линейности.

Методика соответствует критерию сходимости по величинеRSD, %, равному 1.68 % для α-Т и 3.84 % для γ-Т (табл. 3).

vor3a.wmf

а)

vor3b.wmf

б)

Y = aX + b, где a = 5969.58, b = 0.0, R2 = 0.9999506, r = 0.9999753

Y = aX + b, где a = 29267.57, b = 0.0, R2 = 0.9999097, r = 0.9999548

Рис. 3. Калибровочные графики зависимости площади пика токолов от концентрации по хроматограммам образцов фитокомпозиции после гидролиза; внешними стандартами выступали СО токолов а) α-Т; б) γ-Т

Таблица 3

Определение сходимости методики количественного определения токоферолов в фитокомпозиции на примере модельных смесей

Показатели

Повторность

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Сα-Т, мг %

4.5

4.7

4.6

7.3

7.6

7.5

12.3

12.5

12.4

Сγ-Т, мг %

2.9

2.7

3.1

5.8

5.9

5.6

11.3

11.7

11.5

Хср α-Т, мг %

4.60

7.48

12.4

Хср γ-Т, мг %

2.90

5.77

11.5

RSDα-Т, %

2.17

2.05

0.81

RSDγ-Т, %

6.9

2.88

1.73

Таблица 4

Результаты установления правильности методики количественного определения α-токоферола в фитокомпозиции методом добавок

Сисх, мг %

Добавлено СО, мг %

Найдено, мг %

Выход

(Открываемость)

α-Т, %

Выход

(Открываемость)

γ-Т, %

α-Т

γ-Т

α-Т

γ-Т

α-Т

γ-Т

4.5

2.9

10

14.2

12.7

97.93

98.45

4.5

2.9

10

14.3

12.6

98.64

97.67

4.5

2.9

10

14.3

12.9

98.64

100.0

7.5

5.8

20

27.3

25.5

99.30

98.84

7.5

5.8

20

26.4

25.3

96.00

98.06

7.5

5.8

20

27.2

25.9

98.91

100.39

12.5

11.6

30

42.3

41.4

99.53

99.52

12.5

11.6

30

42.6

41.1

100.24

98.80

12.5

11.6

30

42.3

41.8

99.53

100.48

vor4a.wmf vor4b.wmf

a) б)

Рис. 4. ВЭЖ-хроматограмма: a) 2 – β-ситостерол; на врезке представлена калибровочная зависимость А = f (Сβ-ст.); 1 – примесь брассикастерола; б) МСТ; 1 – примесь брассикастерола; 2 – β-ситостерол; 3 – кампестерол, 4 – β-D-β-глюкопиранозидная форма ситостерола

Правильность методики устанавливали методом добавок «введено-найдено» путем измерения количественного содержания α- и γ- токоферолов в растворах при добавлении определенного количества стандартов к исследуемому раствору. Отношение количества введенного токола к найденному (Хср) в % соответствовало 98.75 % (α-Т) и 99.13 % (γ-Т), что характеризует разработанную методику как правильную (табл. 4).

На практике были определены пределы обнаружения, как соотношение сигнал/шум, равное 3/2, и предел количественного определения, как соотношение сигнал/шум 10/1.

Методика имеет предел обнаружения равный 0.0015 ± 0.0002 г/мл, предел количественного определения равный 0.010 ± 0.002 г/мл.

Для анализа β-ситостерола в фитокомпозициина основе МСТ был предложен другой режим ОФ-ВЭЖХ-анализа. Выбор режима проводился с учетом подбора элюента, температуры и длины волны детектирования, используя стандарт β-ситостерола и наличия основных минорных компонентов МСТ – кампестерола и стигмастерола.

В качестве элюента была выбрана смесь растворителей – ацетонитрил: спирт этиловый 96 % (85:15), температура колонки – 40 °С, длина волны 210 нм.

На рис. 4 приведена типичная ВЭЖ-хроматограмма композиции после пробоподготовки.

Показано, что количественное содержание β-ситостерола в фитокомпозиции, определенное по калибровочному графику стандарта β-ситостерола равно 150 ± 10 мг %. Известно, что в большинстве пищевых растительных маслах относительный процент содержания β-ситостерола лежит в интервале 50-70 % от общего количества фитостеролов, что соответствует концентрации β-ситостерола от 100 до 400 мкг %.

Линейность определена при 3 концентрациях β-ситостерола. Уравнение линейной регрессии имеет вид: y = 3449375х.Значение коэффициента корреляции составило 0.999.

Сходимость методики оценивали по величине относительного стандартного отклонения RSD %, которое составляло 3.56 %. Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания β-ситостерола в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Хср находился в пределах от 95,5 до 101,4 %, его средняя величина составила 97,65 %. Таким образом, методика определения β-ситостерола удовлетворяет требованиям по линейности, сходимости, правильности.

На практике были определены пределы обнаружения, как соотношение сигнал/шум, равное 3/2, и предел количественного определения, как соотношение сигнал/шум 10/1.

Методика имеет предел обнаружения равный 0.0075 ± 0.0002 г/мл, предел количественного определения равный 0.050 ± 0.003 г/мл.

Определение бетулина в фитокомпозиции. В качестве элюента была выбрана смесь растворителей – ацетонитрил: вода (90:10), температура колонки – 40 °С, длина волны 210 нм.

На рис. 5 приведена типичная ВЭЖ-хроматограмма бетулина.

Показано, что количественное содержание бетулина в исследуемой фитокомпозиции, определенное по калибровочному графику стандарта бетулина, равно 2.13 ± 0.32 г/100 г

Линейность определена при 5 концентрациях бетулина. Уравнение линейной регрессии имеет вид: y = 6867462х. Значение коэффициента корреляции составило 0.9993. Сходимость методики оценивали величине RSD %, которая составляла 2.8 %.Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания бетулина в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Хср находилось в пределах от 96.15 до 101.42 %, его средняя величина составила 98.31 %.

На практике были определены пределы обнаружения, как соотношение сигнал/шум, равное 3/2, и предел количественного определения, как соотношение сигнал/шум 10/1.

Методика имеет предел обнаружения равный 0.0075 ± 0.0017 г/мл, предел количественного определения равный 0.0500 ± 0.0011 г/мл.

vor5.wmf

Рис. 5. ВЭЖ-хроматограмма бетулина. На врезке представлена калибровочная зависимость А = f (Сбетулина.) – Y = aX + b, где a = 6867462, b = 0.0, R2 = 0.9992550, r = 0.9996274

Выводы

Разработаны и валидированы методики количественного определения бетулина и каротиноидов, токоферолов и β-ситостерола в фитокомпозиции бетулина и тимола в масле семян тыквы. Методики ВЭЖХ-анализа токоферолов, β-ситостерола и бетулина удовлетворяют требованиям по правильности, линейности, сходимости, робастности и характеризуются пределом обнаружения (равном 0.15 ± 0.01 мг/л для α и γ-токоферолов; 0.0075 ± 0.0002 мг/мл для β-ситостерола), пределом количественного определения (равном 1.00 ± 0.02 мг/л для α и γ-токоферолов; 0.050 ± 0.003 мг/мл для β-ситостерола). Пробоподготовка предполагает омыление 60 % водным раствором КОН в присутствии аскорбиновой кислоты и тимола, взятого в 2,5-кратном избытке по отношению к аскорбиновой кислоте. Методика количественного определения суммарного содержания каротиноидов с использованием спектрофотометрии предполагает первичную очистку гексанового экстракта фитокомпозиции от сопутствующих компонентов с помощью адсорбционной колонки, заполненной оксидом магния. Методика характеризуется правильностью, линейностью и сходимостью.


Библиографическая ссылка

Воробьева О.А., Мельникова Н.Б. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДОВ АНАЛИЗА КОМПОНЕНТОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ БЕТУЛИНА И ТИМОЛА В МАСЛЕ СЕМЯН ТЫКВЫ CUCURBITA PEPO // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 10-2. – С. 295-303;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=7487 (дата обращения: 08.08.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074